1. 서 론
조류독소 중 마이크로시스틴류(microcystins, MCs)는 남세균이 생성하는 간 독소물질로 국내에서는 현재 MC-LR을 비롯한 주요 변이체(variants) RR, YR, LA, LY, LF 6종이 먹는물 수질 감시항목으로 지정되어 있다[1]. 현재 대부분 국가에서 MC 표준 분석법으로 LC-MS/MS 기반의 분석방법을 이용하고 있으며, 이는 각각의 대응하는 표준물질을 사용하는 정량 방법으로, 가장 신뢰도 높은 방법으로 제정되어 사용 중이다. 시판 표준물질은 Spirulina의 대량 배양 및 분취 추출 기술로 얻어진 참조표준물질(reference material, RM)이 사용되며 제조사에서 공급 가능한 MC 표준물질은 약 15종 이내인 반면, Pappas 등[2]에 의하면 자연에 존재하는 MC 변이체는 약 280여종이 보고되었다. 2022년부터 세계보건기구(WHO)는 마이크로시스틴에 대한 가이드라인을 MC-LR 중심의 유해성 관리 관점을 유지하면서도 총 MC 농도(total MCs)로서 확장해 갈 것을 제시하고 있다3). 따라서 지금까지 국내 모니터링을 통해 주요 MC 변이체는 3~5종 이내일 것이 예상됨에도 현재의 LC-MS/MS 분석법은 총괄적인 MCs 정보 제공에 한계점이 존재할 가능성이 있다. 미국환경보호청(US EPA)은 MC 측정방법으로 LC-MS/MS(6종 변이체)외에 총량 파악 차원에서 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법도 선택 가능한 것으로 제시하고 있다[4].
한편, 2-methyl-3-methoxy-4-phenylbutyric acid(MMPB) 분석법은 MC의 공통구조인 Adda(3-amino-9-methyoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyl-4,6-decadienoic acid)가 산화되어 공통의 단일 MMPB가 생성되는데 이를 정량하는 방법이다[5](Fig. 1). MMPB로서 검출하기 위해 MC를 과망간산포타슘(KMn04)과 과아이오딘산소듐(NaIO4)을 이용하여 산화 및 후속 정제과정을 거쳐야 한다[6]. 이 방법에서 얻은 단일 결과값은 여러 종류의 MC 표준물질을 구비하지 않아도 총 MC 농도를 대체할 수 있어 미지 MCs를 포함한 결과 확보와 함께 경제적인 이점이 존재한다. 또한, 어류나 퇴적물 등 다양한 매트릭스(matrix)의 시료의 총 MC 농도 측정에 활용되고 있다[7].
MMPB 분석방법과 물환경 조사에 대한 선행 연구는 어류, 조체 등 다양한 유기물 매트릭스 사례를 중심으로 진행된 반면 수질 시료에 대한 적용 사례는 매우 한정되어 있다[8]. 물시료에 적용하는 MMPB 분석 절차로서 시료의 농축, 산화처리, 정제 과정을 거친 후 LC-MS/MS 측정 절차가 진행되며[9], 시료의 농축은 조사 목적, 최적 산화 반응성 등에 따라 다양하게 적용되며, 산화처리 과정에서는 pH, 온도, 산화제 농도, 반응 시간 등의 조건을 고려해야 한다[10]. 또한 산화과정에서 사용한 시약의 염 제거를 위해 정제 과정을 거쳐야 한다[11]. 본 연구진은 최근 선행연구를 통해 물환경 수질시료 분석을 목적으로 한 분석방법으로서 사전 농축을 포함한 산화에서 MMPB 정량에 이르는 전과정에 대한 비교 평가를 진행하고, 수질 분석 방법으로서 절차마련을 시도하였다[12].
MMPB를 분석방법 중 정도관리용 표준물질로 유사 구조물질 및 동위원소 치환 표준물질로서 4-phenylbutyric acid(4-PB)와 erythro-2-methyl-3-(methoxy-d3)-4-phenylbutyric acid(MMPB-d3)가 주로 사용된다[13]. 이들 물질은 연구사례별로 다양하게 적용된 반면 적정성에 대한 세부 검토 내용은 제시되지 않았다. 이에 선행연구에서 4-PB를 대체표준물질로서 적용 시 산화과정에 대한 안정성이 취약한 것을 확인하여 기기 분석 시 내부표준물질로서 사용할 것을 제시하였다[12].
본 연구에서는 선행 연구를 통해 제시한 MMPB 분석 절차의 한계점인 정도관리 사항을 보완하기 위해 정량용 대체표준물질로서 MMPB-d3 추가를 통한 회수율 검토, 정량한계 개선을 위한 대용량 주입법을 시도하였다. 개선된 방법으로 현장 시료 적용을 통해 분석방법 성능과 시료의 MMPB값 도출 및 기존 분석방법에 의한 측정 결과와 비교 등을 시도하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 표준물질 및 시약
MMPB를 정량하기 위해 MC 6종의 표준물질인 MC-LR(Cas No. 101043-37-2), RR(111755-37-4), YR(101064-48-6), LA(96180-79-9), LF(154037-70-4), LY(123304-10-9)을 ENZO Life Sciences에서 구입하였다. 내부표준물질 4-PB(Cas No. 1821-12-1)는 Sigma-Aldrich에서, MMPB-d3는 Wako(FUJIFILM)에서 각각 구입하였다. 기기 분석에 사용하는 메탄올은 Sigma-Aldrich에서, LC/MS 분석용 water는 Supelco에서 구입하였다. 각 표준물질은 50% 메탄올에 용해하여 사용하였다.
2.2. MMPB 분석을 위한 산화처리과정
MMPB를 분석하기 위한 제반 전처리 절차는 선행 연구 절차를 적용하였다[12](Fig. 2). 표준물질 및 시료는 10mL 용량으로 제조 및 분취하여 .85oC 이하에서 48시간 이상 동결 건조하였다. 추출물의 pH를 7 이하로 조정하기 위해 1M 탄산포타슘(K2CO3)을 주입하였다. 산화제는 50 mM 과망간산포타슘(KMnO4)과 50 mM 과아이오딘산소듐(NaIO4)을 각각 주입하여 어두운 상온에서 2시간 동안 반응하고 이 후 40% 황화수소소듐(NaHSO4)를 이용하여 반응을 정지하였다. 다음으로 liquid-liquid extraction(LLE)을 진행하여 산화 후 잔류하는 염을 제거하였다. 이 과정은 과포화 염화소듐(NaCl) 용액을 첨가한 후 ethyl acetate를 1mL 첨가하여 추출하였다. 이 후, N2 가스로 완전히 건고하고 30% 메탄올로 재용리하여 기기 분석을 진행하였다.
2.3. 대체표준물질(surrogate) MMPB-d3 적용
MC 산화 과정을 포함한 분석 전과정의 회수율 및 정량을 위해 MMPB-d3를 surrogate로 사용하여 적합성을 검토하였다. 검정곡선 및 시료에 MMPB-d3는 20 μg/L 이 되도록 주입하였으며, 산화처리전 및 기기분석전에 각각 첨가하여 안정성을 비교하였다. 또한, 산화처리 등 전과정을 거친 MMPB-d3와 기기분석 전에 주입한 4-PB를 이용하여 회수율을 계산하였다.
2.4. 기기분석
Triple Quadrupole LC-MS/MS 시스템은 Shimadzu의 Exion LC 및 QTRAP 6500+(AB SCIEX)를 이용하였다. 분석 컬럼은 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm × 50 mm, 4 μm, Agilent)을 사용하였으며, Multiple reaction monitoring(MRM) mode에서 MMPB, 4-PB, MMPB-d3를 설정하고 분석하였다. 그 외 기기 분석 조건은 Table 1에 기재하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 내부표준물질 MMPB-d3, 4-PB의 적정성
MMPB-d3와 4-PB는 모두 MMPB 정량 분석에서 정도 관리용 표준물질로 적용이 보고되어 있으나 산화처리 안정성에 대한 명확히 제시된 사례가 없어 선행연구[12]에서 이를 확인한 결과, 4-PB는 산화과정에서 분해, 소실되는 것이 관찰되었다. 또한 이 물질은 기기 분석에 대한 내부 표준물질로서 적합성을 확인하였다.
정량용 대체표준물질로서 사용한 MMPB-d3의 피크 세기를 산화 처리 전후 시험에서 비교한 결과, peak 형태는 변화하지 않았고 intensity는 증가하는 경향이 관찰되었다(Fig. 3-1, Fig. 3-2). 산화 후 MMPB-d3의 intensity가 대조 실험으로 비교했던, 산화 없이 기기 분석 직전에 주입한 MMPB-d3보다 증가한 것에서 이 성분은 산화를 통해 matrix effect가 증가(enhancement) 영향을 주는 것으로 보여 검정 곡선을 포함한 전과정에 반영이 필요할 것으로 판단되었다. 전처리 방법의 구성을 달리한 타연구에서 4-PB의 matrix effect는 6%, MMPB-d3는 <0.5%로 MMPB-d3가 매트릭스에 대한 영향은 상대적으로 적은 것으로 보고되었다[14]. 또한, 산화 과정 후 기기 분석 결과에서 peak의 형태도 4-PB에 비해 양호하여 정량용 표준물질로 적합함을 확인하였다[12].
3.2. 개선된 분석 방법의 QA/QC
산화처리 전 주입한 MMPB-d3와 기기분석 전 주입한 4-PB를 이용하여 분석절차의 회수율을 계산하였다. 선행연구[12]의 분석절차를 기반으로 최종 적용한 전과정은 Fig. 2에 요약하였다.
정제수에 첨가한 6종의 마이크로시스틴 변이체 합계 농도는 검정곡선 범위내에서 3 μg/L ~ 30 μg/L 사이에서 첨가하였고 각각 회수율의 평균 및 범위는 Fig. 4에 제시하였다. 첨가한 총MC 농도별 평균 회수율은 78.0% ~ 124.2% 범위로 다양하였으며, 평균 회수율은 101%로 이번에 보완 제시한 분석방법은 선행 연구[12]에서 제시한 약 50%에 비해 유의미한 개선을 확인하였다. 또한, MMPB-d3 적용과, 기기 분석 과정에서 주입량 개선 등으로 산출한 정량한계는 0.11 μg/L로 나타났다. 이 또한 선행연구의 정량한계 4.3 μg/L 대비 뚜렷하게 개선된 결과를 도출하였다.
이번 연구를 통해 제시한 수질분석용 MMPB 분석절차 전과정은 시료의 사전농축에서 산화 및 정제 전과정을 포함한 방법으로서 대체표준물질, 내부표준물질 적용성을 검증하였고, 기기 주입량 개선을 통해 회수율 및 정량한계 성능이 개선되어 저농도 시료에 적용 가능한 것으로 판단된다. 국외에서도 MMPB 측정 연구에서 다양한 시도[5~7,10]가 있었으나, 물시료에 실용적으로 적용 가능한 절차는 보고 사례가 매우 적으며, online 추출방법에 대한 선행 연구[9,14]는 신속한 분석 가능성을 제시하나 조건 최적화, 유지 관리, 재현성 측면에서 어려움이 있을 것으로 예상된다.
3.3. 현장 시료에 대한 분석 방법간 결과 비교
본 연구에서 최적화한 분석방법을 수계 현장 시료에 적용하여 MMPB 정량 결과를 얻은 후, 동일 시료에 대해 기존 분석법인 LC-MS/MS에서 개별 변이체(variants)를 분석한 결과의 합산값과 비교를 통해 상관 관계를 검토하였다. 비교에 사용한 시료는 기존 조사 결과 중 2 μg/L 이상 검출된 시료를 대상으로 하였다. 기존 LC-MS/MS법의 마이크로시스틴 분석 대상은 6종 변이체로서 각 분석 방법의 결과값을 Fig. 5에 비교하였다. 기존 및 신규 분석 방법 간 결과값의 상관계수는 0.80으로 유의미한 양의 상관성이 관찰되었으며, p-value는 p < 0.005로 MMPB 분석방법에서 얻은 결과값은 통계적으로 유의미한 관계가 제시되었다.
여기서 유의할 점은 MMPB 정량 결과는 MC 6종의 총합 농도와 상이한 스케일을 가진다는 점이다. 이 실험에서 관찰된 모든 시료의 MMPB 농도는 MC 6종 정량값보다 낮게 측정되었으며 이는 MMPB 농도가 MCs 농도와 동일하게 표현되지 않음을 의미한다(Fig. 5). 이 현상에 대해 MMPB와 MC 간 분자량 차이 및 이를 화학 양론적으로 설명하기 위한 수식화 모델을 제시된 사례가 있다. Wu 등10)은 MMPB 값과 MC의 평균 분자량 비율, MC 변이체 총합 농도 등을 이용하여 화학양론적 수식화를 도출하고 산출된 전환상수로 총 MC 농도 범위 추정이 가능함을 제시하였다. 이 수식화 과정에 필요한 인자는 대상물질의 분자량, 분자량 비율, 기존 MC 변이체 농도의 합산값 등이며 최종적으로 변환상수 유도를 통해 MMPB값에서 총MCs값 추정이 가능하게 된다. 이러한 수식화 및 비교가 시사하는 점은 기존의 LS-MS/MS로 얻은 MC 변이체 총농도 외에도 시료 중에 미지의 MCs 포함 여부에 대한 정량적 정보를 제공한다는 점일 것이다.
현시점에서 최근까지 시행된 국내 모니터링을 통해 MC 변이체는 상용 표준물질의 범위내에서 주로 검출되는 3~5종 이내일 것으로 판단된다. 다만 녹조관리는 여름철 기온 상승 등 글로벌 규모의 기후변화에 의한 향후 수생태 환경변이 등을 포함해야 하므로 폭넓은 범위의 MC 변이체에 대응하는 분석 기술도 수요가 있을 것으로 기대된다. 앞으로 이러한 신규 방법론을 현장 시료에 지속 적용하여 MMPB 값, 기존 방법에 의한 총MCs 및 변환 상수 자료 축적을 통해 계절, 수계 지점 등 시공간적 특성 검토까지 진행될 경우, 총MCs의 실체에 대한 객관적 이해와 기존 분석법의 보완이 이뤄질 수 있을 것으로 사료된다.
한편, 이러한 총농도 산정법을 이용한 접근은 최근 과불화화합물(PFAS)의 총량을 평가하고자 하는 시도로서 주목받고 있는 TOP(total oxidizable precursor) assay 법과 일정 부분 유사성을 가진다[15]. 이 방법론은 수많은 전구체를 포함한 PFAS 물질을 모두 일일이 분석할 수 없는 한계를 극복하기 위해 시료에 가열을 동반한 알칼리성 활성화된 과황산염 산화를 거쳐 샘플에 존재하는 PFAS 전구체, 특히 카복실산 그룹(-COOH)을 가진 카보닐 그룹으로 변환시키는 등 중간체 및 말단 산화 생성물로 변환시켜 동일 시료에 대한 표적 농도 및 총농도 비교를 통해 전구체의 존재량을 파악할 수 있는 신규 총량 평가방법이다. PFAS 분석에서 중요한 총량 측정 방법으로서 TOP assay 적용 사례가 국내외에서 증가하고 있으며, 실험조건과 결과 해석 시 주의가 요구되나, 환경 시료에서 보다 광범위한 PFAS 오염 총량을 이해하는 데 도움을 주는 것으로 평가받고 있다[16].
본 연구에서 제시한 수질 분석용 MMPB 측정 방법은 기지 MC 및 미지 MC 변이체를 산화하여 공통의 단일 성분으로 전환하고 이를 정립된 전처리와 기기분석법으로 정량하므로 현재 활용중인 표적 MC 중심의 표준 분석법의 한계를 보완하는 수단이 될 것으로 사료된다. 이번 실험은 6종의 MC변이체 표준물질을 MMPB로 변환하여 검정곡선으로 적용했으나 다른 실험에서 검정곡선으로 1종의 표준물질을 이용해도 결과의 동등성을 갖는 점을 확인하는 등 경제적 효과성도 기대된다.
한편, 총MCs를 측정하는 adda-ELISA 방법이 EPA method 546 [4]로 발간되어 미국의 일부 주에서 활용 중이나, 정량 산식 및 분석 원리, 결과 차이점 등으로 인해 LC-MS/MS 분석법의 대안으로서 활용하기에 국내에서는 충분히 검토되지 않았다.
4. 결 론
MMPB 측정방법은 대부분의 마이크로시스틴이 갖는 adda 구조의 산화로 생성되는 공통 구조로서 단일 성분화하여 측정하는 원리를 이용하므로 상용 표준물질의 활용 종류 및 분석대상 MC 종류에 제한없이 총합 농도를 제공할 수 있는 방법으로서 수질 측정용 신규 분석 방법을 개선하고 시료에 적용하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.
정량용 대체표준물질로서 MMPB-d3 적용성을 검토하였으며, 대용량 주입법 등을 포함한 개선된 분석법을 적용한 QA/QC 결과, 분석방법의 양호한 평균 회수율과 정량한계 향상을 확인하였다. 이로써 국외에서도 사례가 거의 없었던 저농도 시료에 적용 가능한 수질분석용 MMPB 분석 절차를 제시하였다.
현장의 수질 시료를 분석 후 기존의 LC-MS/MS 분석법으로 측정된 MC 6종의 합과 MMPB 분석 결과를 비교하면, MMPB의 농도가 MC 6종 농도의 합과 동일하지 않았지만 두 결과의 상관계수는 0.80(p-value < 0.005)로 유의미한 관계가 있음을 확인하였다.
학계에 보고된 마이크로시스틴 변이체가 약 280종에 근접한 것에 비해 상용 표준물질은 매우 제한된 여건에서 신규 분석법은 표준물질에 대한 해외구매 의존도를 낮출 수 있는 잠재적 경제성도 갖춘 방법이다. 향후 현장 MMPB값의 지속적인 데이터 확보와 화학양론적 수식화 비교를 통해 총 MCs 값 추정과 이를 통해 시료 중의 미지 비표적 변이체 포함에 대한 객관적 판단에 기초 자료를 제공할 것으로 기대하며, 이를 통해 현재의 표준분석법을 보완할 수 있는 하나의 대안이 될 수 있을 것으로 판단된다.
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