한강의 어류종 모니터링을 위한 환경 DNA 메타바코딩의 유용성 검토

Examination of the Utility of Environmental DNA Metabarcoding for Monitoring Fish Species in Han Rivr, Korea

Article information

J Environ Anal Health Toxicol. 2024;27(1):39-48

Publication date (electronic) : 2024 March 31

doi : https://doi.org/10.36278/jeaht.27.1.39

Min-Ho Mun , Hyung-Eun An , Chang-Bae Kim ^,

Department of Biotechnology, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea

문민호, 안형은, 김창배^,

상명대학교 융합공과대학 생명공학전공

^†To whom correspondence should be addressed. Tel: 82-2-2287-5288, Fax: 82-2-2287-007, E-mail: evodevo@smu.ac.kr

Received 2023 October 12; Revised 2023 November 13; Accepted 2023 November 30.

Trans Abstract

Han River in Korea is a crucial water resource and fish habitat. Nonetheless, its biodiversity is declining because of anthropogenic activities, particularly pollution. Fish species sensitive to environmental changes are monitored to conserve biodiversity and pollution monitoring. Fish species can be monitored based on environmental DNA (eDNA) which is released by organisms into the environment eDNA metabarcoding can compensate for the difficulties of collection-based fish monitoring and can be used for efficient monitoring. This study aimed to examine the utility of eDNA metabarcoding for monitoring fish species by performing eDNA metabarcoding of fish 12S rRNA from water samples collected from three locations in the Han River. The results were compared with collection-based survey data from the Water Environment Information System (Ministry of Environment of Korea) from the last three years. The results revealed 32 species that were identified in three locations through eDNA metabarcoding analysis. At all locations, eDNA metabarcoding detected 74.4% of the 43 fish species compared with the collection-based survey data, confirming as a valuable tool for monitoring fish species in Han River. Additionally, eDNA metabarcoding can be used as a tool to compensate for the limitations of collection-based surveys by detecting species with hiding characteristics and nocturnal species that are difficult to detect in collection-based surveys. The results of this study can be used as primary data to contribute to the conservation of fish biodiversity in Han River in the future.

Keywords: Fish species monitoring; Environmental DNA; Metabarcoding; Han River

1. 서 론

한강은 국내에서 가장 큰 수계 중 하나로 국내 절반에 가까운 인구의 수자원으로써 기능하며, 다양한 생물의 서식지이자 이동통로 역할을 한다[1,2]. 이러한 중요성에도 불구하고 한강은 주변 도심지로부터의 오염, 도심지 확장, 서식지단편화 등의 인위적인 영향에 노출되어 있으며, 이는 수생태계의 서식 종 변화, 종 다양성 감소 등을 포함한 생물다양성 감소를 야기했다[3]. 한강의 생태계교란과 환경오염을 파악하고 대응하고자 환경 모니터링의 필요성이 대두되었고, 현재 정부 부처와 연구자들에 의해 지속적인 수생생물 모니터링을 수행하고 있다[4]. 모니터링 대상인 수생생물 중 어류는 긴 수명과 높은 이동성을 지니고 있어 넓은 서식지 환경에 노출된 장기간의 영향을 나타내고, 초식, 육식, 잡식, 충식 등 다양한 영양단계의 종들을 포함하여 섭식과 피식, 배설 등을 통해 생태계 내 영양소 순환과 조절에 중요한 역할을 수행한다[5]. 이로 인해 어류는 주요한 모니터링 대상으로 이용되고 있다.

현재 한강의 어류 모니터링은 환경부의 수생태계 현황조사 및 건강성 평가 방법 등에 관한 지침을 기반으로 족대, 투망과 같은 어구를 활용한 정기적인 채집을 통해 이루어진다[6]. 이러한 채집기반조사는 채집된 어류를 연구자가 직접 확인하여 개체의 건강성을 평가할 수 있으며, 어류평가지수 (Fish Assessment Index, FAI)와 같은 정량적인 결과를 얻을 수 있다는 장점을 가진다[7,8]. 그러나, 분류전문가의 감소로 인해 채집조사 인원이 부족하다는 점과 채집조사 시 강도 높은 현장조사가 동반된다는 점은 채집에 기반한 모니터링을 어렵게 만든다[9,10]. 뿐만 아니라, 야행성, 바위나 돌 틈 등 은신처에 숨는 행동특성을 가진 종 등 생태적 특성으로 인해 채집이 어려운 종들의 경우 검출하지 못할 가능성이 있다. 이와 같은 종들을 검출하기 위해선 많은 시간, 비용 및 인력이 소요된다[11,12]. 따라서, 채집기반 모니터링 방식의 이러한 어려움을 보완할 방법이 필요하다.

최근 채집기반조사의 보완적인 방법 중 하나로써 배설물, 체액, 조직 등 유기체에서 주변환경으로 유리된 유전 물질인 환경 DNA (environmental DNA, eDNA)가 환경에 서식하는 생물종을 검출하기 위한 방법으로 주목받고 있다[13,14]. eDNA 메타바코딩을 통해 환경시료에서 다수의 생물을 동시에 식별할 수 있을 뿐 아니라, 생물을 직접 포획하지 않고 물과 같은 환경 시료를 채집하므로 어류에게 비침습적인 모니터링이 가능하다[15]. 또한, 채집 및 관찰이 어려운 어류종도 검출할 수 있어 채집기반의 현 모니터링 방식을 보완하기 위한 방법으로 관심을 받고 있다[16]. 국내에서는 eDNA 메타바코딩을 통해 담수어류의 생물다양성 모니터링 연구[17]와 하천 어류 군집 분석[18]에 이용한 연구 등이 수행되었으나, 한강에서 어류종을 모니터링하기 위해 이용된 사례는 전무하다.

본 연구는 한강 어류종 모니터링을 위한 eDNA 메타바코딩 기법의 유용성을 검토하고자 수행한 예비연구로, 한강의 3개 지점에서 eDNA 메타바코딩 기법을 이용하여 어류종을 검출하고 채집기반의 조사 기록인 물환경정보시스템의 생물측정망 데이터와 비교하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. Environmental DNA 채집

eDNA가 포함된 물 시료는 2022년 6월 한강의 세 지점에서 수집하였다 (Table 1). 물 시료는 수도권 내 한강 수역 중 상류인 팔당호, 중류인 잠실대교, 하류인 행주대교 인근에서 수집하였다. 시료 수집지점은 조사방법에 따른 결과를 비교할 수 있도록 환경부 생물측정망에서 채집을 수행한 장소와 동일하게 선정하였다. 멸균 채수병을 이용해 각 지점 내에서 서로 약 50 m 거리를 두고 2 L씩 다섯 번으로 나누어 채집하여 지점별로 10 L의 물 시료를 얻었다. 물 시료 채집 시, Apera PC 8500 portable metre (Apera Instruments, Wuppertal, Germany)를 이용해 수온, pH, salt, 전기전도도 총 네 가지 환경적 요소를 측정하였다 (Table 1). 수집한 모든 시료는 degradation을 최소화하기 위해 여과 전까지 4°C에서 냉장 보관하였으며, 수집 후 12시간 이내에 여과하였다.

Table 1.

Information of three freshwater sampling locations and environmental factors in Han River

eDNA를 포집하고 박테리아를 제거하기 위해 기공 크기가 0.45 µm, 직경이 47 mm인 Cellulose nitrate (CN) membrane filter (Whatman, Maidstone, UK)와 진공 펌프(GAST, Michigan, USA)를 이용하여 물 시료를 여과하였다. 채집지점에 따른 편차를 최소화하기 위해 물 시료는 여과 과정에서 지점별로 풀링 (pooling)하였다. 여과 과정은 시료 간 교차오염을 방지하기 위해 시료별로 분리된 공간에서 멸균된 도구를 이용하여 수행되었다. 여과가 완료된 membrane filter는 후속 과정을 진행하기 전까지 50 ml 멸균 conical tube에 담아 −20°C에서 냉동 보관하였다.

2.2. DNA 추출과 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)

Membrane filter에서 DNA를 추출하기 위해 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하였다. 시료의 교차오염을 예방하기 위해 실험은 각 시료별로 독립적으로 수행하였으며, 실험을 진행하기 전 실험공간을 DNA AWAY (Molecular BioProducts, California, USA)로 소독하고 실험도구를 고압증기멸균 처리를 하여 생물활성을 제거하였다. Membrane filter는 멸균 가위를 이용하여 0.5 mm × 0.5 mm 이내의 조각으로 잘라 50 ml conical tube으로 옮겼다. 여과지에서 DNA를 회수하기 위해 여과지 당 0.9 ml의 ATL 용액을 투입하고 60°C에서 1시간 동안 shaking incubation 하였다. 이후 여과지를 conical tube에서 제거하고, 남은 용액을 0.5 mm 직경의 지르코늄 비드 1 g이 포함된 2 ml 멸균 collection tube (BioFactories, Daejeon, Korea)에 옮겨 담았다. 시료의 균질화를 위해 bead buddy (BioFactories, Daejeon, Korea)를 이용하여 45초 동안 4,000 rpm으로 분쇄하고 1 분 동안 얼음 위에서 냉각하는 과정을 3 회 반복하였다. 이후 lysis를 위해 시료를 60°C에서 overnight하였다. 이후 과정은 제조사의 가이드라인에 따라 진행하였다. 추출한 Total DNA는 후속 과정이 수행되기 전까지 −20°C에서 냉동 보관하였다.

Total DNA에서어류의 12S ribosomal RNA (12S rRNA) gene 부위를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 모든 DNA 시료는 50 ng으로 정량한 후 12S rRNA gene의 변이가 많은 영역 (hypervariable region)을 포함한 약 170 base pair 크기영역을 표적으로 하는 MiFish-U-F (5'-GTC GGT AAA ACT CGT GCC AGC-3'), MiFish-U-R (5'-CAT AGT GGG GTA TCT AAT CCC AGT TTG-3') 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다[19]. PCR을 위해 주형 DNA 1 µl (50 ng / µl), Taq 중합효소 0.2 µl (5 U / µl), 10 × Reaction Buffer 와 10 mM dNTP를 각각 2 µl 씩, 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1 µl 씩, 그리고 증류수를 12.8 µl 투입하여 총 용량 20 µl를 맞추었다. PCR 조건은 95°C에서 3분 동안 초기 변성 (denaturation)을 진행하고, 이후 94°C에서 20초 동안 변성, 48°C에서 15초 동안 어닐링 (annealing), 72°C에서 15초 동안 신장 (extension)하는 과정을 35 cycle 반복하고, 72°C에서 5분 동안 최종 신장 과정을 거쳤다. 각각의 시료에서 얻은 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하고 라이브러리 제작 전 지점 별로 동일한 양으로 풀링하였다.

2.3. 라이브러리 제작 및 시퀀싱

각각의 시료에서 얻은 PCR 산물을 AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 정제하고 20 µl의 elution buffer로 추출하였다. Nextera XT DNA index kit (Illumina, San Diego, CA)를 이용해 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 산물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 최종 라이브러리의 순도와 양은 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, California, USA)를이용하여측정하였다. 시퀀싱은 Illumina MiSeq (paired-end × 300 base pair) 플랫폼을 통해 진행되었다.

2.4. 데이터 처리 및 생물정보학적 분석

모든 데이터세트는 QIIME2 pipeline v 2022.2 [20]를 이용하여 처리하였다. QIIME2 pipeline의 DADA2 [21]을 이용하여 시퀀싱 에러로 판단되는 낮은 품질의 read를 제거하는 노이즈 제거 과정을 거쳤다. Read의 품질 점수에 기반하여 각 서열의 첫 13 base pair (bp)를 제거하였으며, 어댑터 서열을 제거한 후 모든 서열을 150 bp에 맞춰 trimming하였다. 이어서 품질이 낮은 서열과 chimeric sequence를 제거하였다. DADA2를 이용하여 paired-end read를 앰플리콘 서열 변이체 (amplicon sequence variants, ASVs)로 조립하였다. ASVs는 시퀀싱 오류가 발생하기 전 생물학적 염기서열을 추론하는 방법으로, 정해진 서열 임계값에 따라 클러스터링되는 operational taxonomic units (OTUs) 방식보다 해상도가 높기 때문에 사용하였다[21]. eDNA 메타바코딩의 시퀀싱 depth가 샘플의 종을 나타내기 충분한지 평가하기 위해 QIIME2를 이용하여 rarefaction curve을 계산하였다. Rarefaction curve는 시퀀싱 depth를 0에서 100%까지 30개 단계로 나누어 시퀀싱 depth에 따른 Shannon 다양성 지수를 측정하여 계산하였다.

서열의 분류학적 할당 과정에서 참조 데이터로 사용하기 위해 MitoFish 데이터베이스[22]를 이용하였다. 데이터베이스 내의 12S rRNA 유전자는 Mitohelper [23]를 이용하여 수집하였다. 수집한 12S rRNA 유전자를 참조 데이터로 QIIME2의 Consensus-BLAST [24]를 통해 서열의 분류학적 할당을 수행하였다. 분류학적 할당 과정이 완료된 후 어류가 아닌 서열과 담수에 서식하지 않는 어류종 및 종 수준으로 분류되지 않은 어류는 분석에서 제외하였다. 어류종의 분류학적 정보를 확인하기 위해 Biopython의 ete3 [25]를 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy (www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/) [26]에서 분류학적 정보를 얻었다. 이를 기반으로 eDNA 메타바코딩을 이용하여 검출한 종 수를 지점별로 비교하기 위해 벤 다이어그램으로 나타냈다.

2.5. eDNA 메타바코딩 데이터와 물환경정보시스템 생물측정망 데이터의 어류종 비교

채집에 기반한 어류 조사자료는 환경부 물환경정보시스템 (water.nier.go.kr) [4]에서 제공하는 생물측정망 자료를 이용하였다. 물환경정보시스템은 하천 환경과 수생생물의 모니터링을 위해 환경정책기본법(법률 제18918호)과 물환경보전법(법률 제18469호)에 의거한 국립환경과학원의 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가 방법 등에 관한 지침[6]에 따라 2011년부터 전국의 하천, 하구와 호소 등 총 3,883개 지점에서 채집기반조사를 연 2회 실시하고, 그 결과를 생물측정망으로 공개하고 있다. 본 연구에서는 물환경정보시스템 생물측정망에서 eDNA 채집지점과 동일한 지점의 2020년부터 2022년까지 최근 3년간 출현한 어류종 데이터를 수집하였다. 그리고, 이 중에서 본 연구의 채집시기와 유사한 시기인 봄철에 수집한 1차 데이터를 이용하였다. 그 뒤 eDNA 메타바코딩으로 검출된 어류종과 생물측정망 데이터를 비교하여 각 방법으로 식별된 종 목록을 표로 정리하였다. eDNA 메타바코딩 및 생물측정망 출현종의 분류학적 정보는 NCBI Taxonomy의 분류체계를 따랐다. 어류종 검출을 위한 eDNA 메타바코딩의 유용성을 평가하기 위해 eDNA 메타바코딩과 생물측정망 데이터를 이용하여 검출된 어종의 수를 기반으로 이전 연구[27,28]에 따라 eDNA 메타바코딩 분석의 민감도 (1)를 계산하였다. 생물측정망 데이터의 양성은 생물측정망 데이터에서 출현한 종으로 정의하였다. 마찬가지로 eDNA 메타바코딩 분석에서 양성은 eDNA 메타바코딩 분석을 통해 실제로 검출된 종으로 정의하였다. 이를 바탕으로 진양성은 eDNA 메타바코딩 분석과 생물측정망 데이터 모두에서 양성으로 검출된 종으로 정의하였다. 민감도는 eDNA 메타바코딩을 통해 검출된 어류 중 생물측정망에 보고된 어류의 비율을 의미한다. 생물측정망에 기록되지 않은 어종이라도 음성으로 간주하지 않았는데, 이는 생물측정망 데이터가 표본 채취 지점에 존재하는 어종을 누락할 수 있기 때문이다.

민감도 =(생물측정망과 메타바코딩에서 공통적으로 검출된 종의 수)(생물측정망에서 검출된 종의 수)

3. 결과 및 고찰

3.1. eDNA 메타바코딩 분석

한강의 어류 eDNA 메타바코딩 분석 결과 3개 지점에서 총 923,900개의 raw read를 얻었으며, 시료당 평균 307,967개의 read를 얻었다 (Table 2). Read processing 결과 지점별로 평균 약 377개의 ASV를 얻었으며, ASV에 포함되는 read 개수는 잠실이 151,276개로 가장 많고 팔당이 53,292개로 가장 적었다. 각 지점의 시료에 대해 추정한 rarefaction curve는 모든 시료에서 포화단계에 근접하는 형태로 나타나, 시료에 존재하는 대부분의 ASV를 얻기 위해 시퀀싱 depth가 적절하였음을 확인하였다(Fig. 1).

Table 2.

Summary of reads that remained at each stage during denoising

Fig. 1.

Rarefaction curves for three samples. The curves show the predicted total diversity by sequencing depth. The x-axis represents the sequencing depth of samples, and the y-axis represents a measure of the species richness, estimated using the Shannon index. The locations corresponding to each curve were shown to the right of the figure. PL: Paldang Lake (팔당); JB: Jamsil Bridge (잠실); HB: Haengju Bridge (행주).

eDNA 메타바코딩 분석을 통해 총 3개 지점에서 19과 28속 32종이 식별되었다 (Fig. 2). 이 중 6종은 모든 지점에서 공통적으로 검출되었다. 지점별로 검출된 종의 수는 잠실이 22종으로 가장 많았으며, 행주가 17종으로 뒤를 이었고, 팔당은 12종이 검출되어 가장 적었다 (Fig. 2). 각 지점에서만 특이적으로 검출되는 종에는 차이가 있었다. Misgurnus bipartitus, Monopterus albus (드렁허리), Odontobutis interrupta (얼록동사리)등 3종은 상류인 팔당에서만 검출되었다. 잠실의 경우, Abbottina rivularis (버들매치), Acheilognathus rhombeus (납지리), Anguilla australis, Pseudorasbora parva (참붕어), Pungtungia herzi (돌고기), Rhodeus ocellatus (흰줄납줄개), Siniperca scherzeri (쏘가리), Tanakia lanceolata (납자루), Acheilognathus yamatsutae (줄납자루)등 9종이 확인되었다. 한편, Hyporhamphus intermedius (줄공치), Plecoglossus altivelis (은어), Acanthogobius hasta (풀망둑), Coilia nasus (웅어), Planiliza haematocheilus (가숭어), Trachidermus fasciatus (꺽정이), Tridentiger bifasciatus (민물두줄망둑) 등 7종은 행주에서만 검출되었다. 행주 지점에서만 검출된 7종은 모두 담수와 해수가 섞이는 기수지역에 서식하는 종[29-31]이거나 연안과 담수를 오가는 종[32-34]이다. 이러한 어류종은 한강의 하구에서 가까운 하류지역인 행주 지점의 지리적, 환경적 특성[35]에 의해 검출된 것으로 사료된다.

Fig. 2.

Venn diagram showing the number of detected species based on eDNA metabarcoding analysis (n = 42). Green, number of detected species from Paldang Lake (PL). Red, number of detected species in Jamsil Bridge (JB). Blue, number of detected species in Haengju Bridge (HB). The intersection of two circles indicates the number of detected species.

한편, eDNA 메타바코딩을 통해 두 지점에서 공통적으로 검출된 어류도 있었다. Lepomis macrochirus (블루길), Misgurnus anguillicaudatus (미꾸리), Zacco platypus (피라미)등 3종은 팔당과 잠실에서 공통적으로 검출되었다. 잠실과 행주에서 동시에 검출된 종은 Acheilognathus chankaensis (가시납지리), Mugil cephalus (숭어), Silurus asotus (메기), Lateolabrax japonicus (농어) 등 4종이었다. 이와 달리, 팔당과 행주에서 공통적으로 검출된 종은 없었다. 이러한 결과는 팔당은 상류인 반면, 행주는 하류로써 중류인 잠실 지역을 사이에 두고 지리적으로 떨어져있기 때문으로 사료된다. 또한 채집기반의 이전 연구에 따르면 한강 상류와 하류 간의 환경 요소에 차이가 나타나며 서식하는 생물이 다르다고 알려져 있다[36,37]. 이러한 팔당과 행주의 지리, 환경의 차이로 인해 공통적으로 검출된 어류종이 나타나지 않은 것으로 추정된다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, eDNA 메타바코딩은 한강의 각 지점에서 어류종을 검출하고 지점별로 비교분석하기 위한 유용한 어류 모니터링 도구로 이용 가능하다고 판단된다.

3.2. eDNA 메타바코딩 검출종과 물환경정보시스템 생물측정망 출현종의 비교

eDNA 메타바코딩을 이용한 한강 어류종 모니터링의 유용성을 확인하기 위해 eDNA 메타바코딩을 이용한 검출 어류종과 환경부의 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가 방법 등에 관한 지침[6]에 따라 2020년부터 2022년까지 최근 3년동안 수행된 물환경정보시스템 어류 생물측정망에 기록된 출현 어류종[4]을 비교하였다 (Fig. 3, Table 3). 2020년부터 2022년까지 기록된 어류 생물측정망 데이터에 따르면 3개 지점에서 출현한 종 수는 총 9과 18속 21종으로, eDNA 메타바코딩을 통해 검출된 어류종 수의 72.1% 수준이었다. 각 지점별 생물측정망 데이터에 따르면, 팔당의 경우, 6과 8속 9종이 기록되었으며 eDNA 메타바코딩을 통해 이 중 5종이 확인되었고 (55.6%), 7과 7속 7종이 새롭게 검출되었다. 잠실 생물측정망 데이터에서 6과 13속 13종이 기록되었으며 이 중에서 5종이 eDNA 메타바코딩을 통해 공통적으로 식별되었고 (38.5%), 13과 16속 17종의 새로운 어류종이 검출되었다. 행주 생물측정망 데이터에 7과 13속 14종의 출현을 확인하였으며 eDNA 메타바코딩으로는 17종이 검출되었다. 이 중에서 4종 (28.6%)은 공통적으로 확인되었고, 12과 13속 13종이 새롭게 식별되었다. eDNA 메타바코딩으로 검출된 종 중에서 Tridentiger brevispinis (민물검정망둑)는 3개 지점에서 모두 검출되었으며, 마찬가지로 생물측정망 조사를 통해서도 세 지점 모두에서 출현한 것을 확인하였다. Micropterus salmoides (배스)와 Zacco platypus (피라미)는 팔당과 잠실에서 eDNA 메타바코딩과 생물측정망 조사를 통해 모두 검출되었다. Tanakia lanceolata (납자루)는 eDNA 메타바코딩과 생물측정망 조사에서 공통적으로 잠실 지점에서만 검출되었고, Planiliza haematocheilus (가숭어), Tridentiger bifasciatus (민물두줄망둑) 등 2종은 공통적으로 행주 지점에서만 검출되었다. 두 방법을 통해 팔당 16종, 잠실 30종, 행주 27종으로 3개 지점에서 총 43종의 어류가 확인되었다. 이 중 eDNA 메타바코딩으로는 74.4%를 검출하였고, 채집기반의 생물측정망은 48.8%를 검출하여 eDNA가 채집기반조사 보다 상대적으로 높은 검출 효율성을 보였다 (Table 3). Fig. 3의 좌측은 eDNA 메타바코딩, 생물측정망의 채집기반조사 데이터를 이용하여 확인된 어종을 비교한 벤다이어그램이다. 우측은 각 위치에서 eDNA와 채집기반 조사 데이터의 민감도를 비교하는 막대 그래프이다. 어류종 검출의 유용성을 평가하기 위해 eDNA의 민감도를 계산하였다. 세 지점의 평균 민감도는 46.5%로 38.5% (JB) ~ 60.0% (PL)의 범위로 계산되었다 (Fig. 3). 본 연구에서 수행한 eDNA 메타바코딩은 1회 채집을 기반으로 이루어졌으나, 생물측정망의 데이터는 비교적 장기간동안 이뤄진 3년간의 조사 데이터를 이용하였다. 이러한 조사 기간의 차이가 비교적 낮은 민감도의 원인으로 사료된다.

Fig. 3.

Venn diagrams indicating the number of detected species and bar charts indicating the sensitivity of environmental DNA (eDNA) metabarcoding analyses. Data show fish species detected by eDNA metabarcoding and collection-based survey data at each sampling location. (A) Venn diagram of all sampling locations, (B) Venn diagram of Paldang Lake, (C) Venn diagram of Jamsil Bridge, (D) Venn diagram of Haengju Bridge, and (E) sensitivity of each sampling location. n = number of species

Table 3.

Species detected with eDNA metabarcoding (E) and collection-based survey data (T) in each sampling location

한편, eDNA 메타바코딩으로 검출한 종 중 생물측정망 조사에서 출현하지 않은 22종이 포함되었다 (Table 3). 새롭게 검출된 종 중 Siniperca scherzeri (쏘가리)는 바위나 돌 틈 등 은신처에 숨는 행동특성을 가진 것으로 알려졌다[38]. 이처럼 숨는 습성을 가진 종은 관찰의 어려움으로 인해 채집기반조사를 통해 확인하기 어려우며, 특히 개체 밀도가 낮은 경우 이러한 종들을 검출하기 위해 많은 채집 노동력과 시간이 필요한 것으로 알려졌다[39]. 이와 유사하게, 주간에는 돌 틈, 진흙 등에 숨고 야간에 활동을하는 야행성 어류인 Channa argus (가물치) [40], Monopterus albus (드렁허리) [41]도 이번 eDNA 메타바코딩을 통해 새롭게 검출되었다. 주간에 활동량이 적고 숨어 있는 습성을 가진 야행성 종의 경우, 주간에는 수집이 어려울 수 있다. 생물측정망 채집이 주간에 수행되는 것과 달리 야행성 어류종은 밤에 활동하기 때문에 야행성 어류의 활동 시간과 채집조사 시간의 차이가 있으며, 이로 인해 채집 기반조사를 통해 검출되지 않았을 가능성이 있다. 실제로 이전 연구에 따르면, 동일한 채집일의 주간과 야간에 수행된 채집기반조사를 비교한 결과 검출되는 종에 차이가 있었다[42]. 반면, eDNA 메타바코딩은 어류에서 방출된 eDNA를 탐지하므로, 이와 같은 숨는 특성을 가진 어류종과 야행성 어류종까지 검출 가능함이 이전 연구를 통해 확인되었다[43,44]. 본 연구의 eDNA 메타바코딩 결과 또한 앞선 연구와 유사하게 숨는 습성을 가진 어류 1종과 야행성 어류 2종을 검출하였다. eDNA 메타바코딩이 채집기반으로 확인된 어류종 뿐만 아니라 숨는 습성을 가진 종과 야행성 어류종 등 채집을 통한 모니터링이 어려운 어류종을 검출하기 위해 유용하게 활용할 수 있다는 점을 보여준다.

모니터링에서 출현하는 어류종은 어류의 생활사와 같은 생물학적 요소, 계절, 채집 지점에 따른 환경요소 변화에 의해 영향을 받을 수 있다[45]. 이전 연구에 따르면 온도에 의한 eDNA의 분해 속도 변화로 인해 어류의 검출 가능 기간이 달라질 수 있으며, 탁도와 pH에 의해 얻어지는 eDNA의 양에 차이가 발생할 수 있다[46-48]. 실제로 본 연구 결과 세 지점 중 수온이 가장 높았던 PL에서 eDNA를 통해 가장 적은 수의 종이 검출되었다 (Table 1, Fig. 3). 그러나 본 연구는 예비연구로, eDNA의 유용성을 확인하고자 특정한 시기에 수행하여 수온으로 인한 차이인지 또는 지점에 서식하는 어류종이 실제로 적은 것인지 통계적 유의성을 확인하기 어려웠다. 이러한 환경요인을 비교하기 위해, 향후 연구에서는 장기 모니터링을 수행하여 실제 서식 어류종을 확인하여 eDNA 메타바코딩 데이터의 신뢰성을 확보하고, 동시에 환경요인이 다른 다양한 장소에서 어류종 모니터링 자료를 확보하여 환경요소와 연관성을 분석하여야 한다. 추가로 eDNA는 상대적으로 안정적이라는 특성으로 인해 상류에서 서식하는 생물에 의한 eDNA가 검출될 가능성이 있다. 이를 보완하기 위한 방법 중 하나는 상대적으로 환경에서 안정성이 낮은 environmental RNA (eRNA)를 이용할 수 있다[28]. 따라서 향후 연구에서는 eDNA와 eRNA를 결합한 메타바코딩을 통해 분석의 정확도를 개선할 필요성이 제기된다. 이를 통해 eDNA 메타바코딩 조사를 표준화하기 위한 국내 실정에 적절한 기초 자료를 제공하고, 검출이 어려운 종을 식별하는 등 기존의 채집 방법의 한계를 보완하며 함께 이용함으로써 한강 어류종 생물다양성 보전을 위한 모니터링에 기여할 수 있을 것이다.

4. 결 론

본 연구는 eDNA 메타바코딩 기법을 이용하여 한강의 어류종을 모니터링하기 위한 예비연구로서, 채집기반의 조사 기록과 비교하여 eDNA 메타바코딩 기법을 이용한 어류종 모니터링의 유용성을 제시하였다. 또한 eDNA 메타바코딩은 채집이 어려운 숨는 행동특성을 가진 종, 야행성 종 등을 식별할 수 있음을 확인하였다. 따라서 eDNA 메타바코딩은 채집기반조사를 보완하여 환경에 실제로 서식하는 어류의 모니터링 정확도를 효과적으로 향상하기 위해 활용할 수 있을 것이다. 본 연구의 결과는 추후 한강 어류종 생물다양성 모니터링과 보전에 기여하기 위한 기초 자료로서 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgements

본 논문은 정부(환경부)의 재원으로 국립생물자원관의 지원을 받아 수행하였습니다 (NIBR202333202).

References

1. Byeon H. – K.. Characteristic of fish community in the stream flowing into the Han River in Seoul, Korea. Korean Journal of Environment and Ecology 2018;32(3):261–273.

2. Choi T. - J., Malik A., An H. - E., Kim J. -I., Dinh Do T., Kim C. – B.. Seasonal diversity of microeukaryotes in the Han River, Korea through 18S rRNA gene metabarcoding. Evolutionary Bioinformatics 2022;18:11769343221074688.

3. Kim G. B., Kil H. K., Yu B. T., Kim M. Y., Bae K. S.. Long-term changes of the fish fauna and community structure in the Jungrang Creek, Seoul, Korea. Korean Journal of Ecology and Environment 2002;35(2):63–70.

4. 환경부. Water Environment Information System, Korea 2022.

5. Holmlund C. M., Hammer M.. Ecosystem services generated by fish populations. Ecological Economics 1999;29(2):253–268.

6. 국립환경과학원. 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가 방법 등에 관한 지침 -하천편- 국립환경과학원고시. 2019-52호. 2019.

7. An K. -G., Lee S. -J.. Ecological health assessments, conservation and management in Korea using fish multimetric model. Korean Journal of Ecology and Environment 2018;51(1):86–95.

8. Weigand H., Beermann A. J., Čiampor F., Costa F. O., Csabai Z., Duarte S., Geiger M. F., Grabowski M., Rimet F., Rulik B., Strand M., Szucsich N., Weigand A. M., Willassen E., Wyler S. A., Bouchez A., Borja A., Čiamporová-Zaťovičová Z., Ferreira S., Dijkstra K.- D. B., Ekrem T.. DNA barcode reference libraries for the monitoring of aquatic biota in Europe: Gap-analysis and recommendations for future work. Science of the Total Environment 2019;678:499–524.

9. Hopkins G. W., Freckleton R. P.. Declines in the numbers of amateur and professional taxonomists: implications for conservation. In Animal Conservation Forum 2002;5(3):245–249.

10. Guillera-Arroita G.. Modelling of species distributions, range dynamics and communities under imperfect detection: advances, challenges and opportunities. Ecography 2017;40(2):281–295.

11. McDonald L. L.. Sampling rare populations. Sampling rare or elusive species 2004. Island Press. USA:

12. MacKenzie D. I., Nichols J. D., Andrew Royle J., Pollock K. H., Bailey L., Hines J. E.. Occupancy estimation and modeling: inferring patterns and dynamics of species occurrence Elsevier; 2017.

13. Cristescu M. E, Hebert P. D. N. Uses and misuses of environmental DNA in biodiversity science and conservation. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 2018;49:209–230.

14. Deiner K., Bik H. M., Mächler E., Seymour M., Lacoursière?Roussel A., Altermatt F., Creer S., Bista I., Lodge D. M., de Vere N., Pfrender M. E., Bernatchez L.. Environmental DNA metabarcoding: Transforming how we survey animal and plant communities. Molecular Ecology 2017;26(21):5872–5895.

15. Bohmann K., Evans A., Gilbert M. T. P., Carvalho G. R., Creer S., Knapp M., Yu D. W., de Bruyn M.. Environmental DNA for wildlife biology and biodiversity monitoring. Trends in Ecology & Evolution 2014;29(6):358–367.

16. Song Y., Kim J., Won S., Park C.. Possibility in identifying species composition of fish communities using the environmental DNA metabarcoding technique-with the preliminary results at urban ecological streams. Journal of the Korean Society of Environmental Restoration Technology 2019;22(6):125–138.

17. Kim J. -H., Jo H., Chang M. -H., Woo S. -H., Cho Y., Yoon J. – D.. Application of environmental DNA for monitoring of freshwater fish in Korea. Korean Journal of Ecology and Environment 2020;53(1):63–72.

18. Yoon M. -R., Oh S. -E., Cho Y. -S., Ahn H. -J., Kwak M. -J., Han S. -H., Kim T. -H., Lee K. -H., Hong S. -M., Jeong J.. Using eDNA Metabarcoding for the analysis of fish communities in Rivers. Journal of Environmental Analysis Health and Toxicology 2023;26(2):89–96.

19. Miya M., Sato Y., Fukunaga T., Sado T., Poulsen J. Y., Sato K., Minamoto T., Yamamoto S., Yamanaka H., Araki H., Kondoh M., Iwasaki W.. MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Royal Society open science 2015;2(7):150088.

20. Bolyen E., Rideout J. R., Dillon M. R., Bokulich N. A., Abnet C. C., Al-Ghalith G. A., Alexander H., Alm E. J., Arumugam M., Asnicar F., Gregory Caporaso J.. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature biotechnology 2019;37(8):852–857.

21. Callahan B. J., McMurdie P. J., Holmes S. P.. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. The International Society for Microbial Ecology journal 2017;11(12):2639–2643.

22. Iwasaki W., Fukunaga T., Isagozawa R., Yamada K., Maeda Y., Satoh T. P., Sado T., Mabuchi K., Takeshima H., Miya M., Nishida M.. MitoFish and MitoAnnotator: a mitochondrial genome database of fish with an accurate and automatic annotation pipeline. Molecular biology and evolution 2013;30(11):2531–2540.

23. Lim S. J., Thompson L. R.. Mitohelper: A mitochondrial reference sequence analysis tool for fish eDNA studies. Environmental DNA 2021;3(4):706–715.

24. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden T. L.. BLAST+: architecture and applications. BioMed Central bioinformatics 2009;10:1–9.

25. Huerta-Cepas J., Serra F., Bork P.. ETE 3: Reconstruction, analysis, and visualization of phylogenomic data. Molecular biology and evolution 2016;33(6):1635–1638.

26. Schoch C. L., Ciufo S., Domrachev M., Hotton C. L., Kannan S., Khovanskaya R., Leipe D., Mcveigh R., O’Neill K., Robbertse B., Sharma S., Soussov V., Sullivan J. P., Sun L., Turner S., Karsch-Mizrachi I.. NCBI Taxonomy: a comprehensive update on curation, resources and tools. The Journal of Biological Databases and Curation 2020;2020:baaa062.

27. Miyata K., Inoue Y., Amano Y., Nishioka T., Yamane M., Kawaguchi T., Morita O., Honda H.. Fish environmental RNA enables precise ecological surveys with high positive predictivity. Ecological Indicators 2021;128:107796.

28. An H. -E., Mun M. -H., Kim C. -B.. Metabarcoding by combining environmental DNA with environmental RNA to monitor fish species in the Han River, Korea. Fishes 2023;8(11):550.

29. Riede K.. Global register of migratory species: from global to regional scales: final report of the R&D-Projekt 808 05 081 2004. Federal Agency for Nature Conservation. Germany:

30. Collette B. B., Su J.. The halfbeaks (Pisces, Beloniformes, Hemiramphidae) of the far east. In : Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia; 1986. p. 250–302.

31. Pietsch T. W., Amaoka K., Stevenson D. E., MacDonald E. L., Urbain B. K., Lopez J. A.. Freshwater fishes of the Kuril Islands and adjacent regions. Species diversity 2001;6(2):133–164.

32. McDowall R. M.. The evolution of diadromy in fishes (revisited) and its place in phylogenetic analysis. Reviews in Fish Biology and Fisheries 1997;7:443–462.

33. Nishida M.. Geographic variation in the molecular, morphological and reproductive characters of the ayu Plecoglossus altivelis (Plecoglossidae) in the Japan-Ryukyu Archipelago. Japanese Journal of Ichthyology 1986;33(3):232–248.

34. Takeshita N., Onikura N., Nagata S., Matsui S., Kimura S.. A note on the reproductive ecology of the catadromous fourspine sculpin, Cottus kazika (Scorpaeniformes: Cottidae). Ichthyological Research 1999;46:309–313.

35. Park G. S.. Salinity distribution and ecological environment of Han River estuary. Journal of Wetlands Research 2004;6(1):149–166.

36. Moon B. R., Jeon S. L., Hyun M. S., Hwang J. S., Choi J. K.. A Study on Fish Fauna and Fish Habitat - Downstream of Singok Submergerd Weir in Han River Estuary-. Journal of Environmental Impact Assessment 2011;20(5):757–764.

37. 이 기영, 김 미경, 한 송희, 백 경오. 팔당댐 어도 설치를 위한 기초조사 연구. 정책연구 2017;:1–119.

38. Itakura H., Wakiya R., Yamamoto S., Kaifu K., Sato T., Minamoto T.. Environmental DNA analysis reveals the spatial distribution, abundance, and biomass of Japanese eels at the river-basin scale. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems 2019;29(3):361–373.

39. Hinlo R., Lintermans M., Gleeson D., Broadhurst B., Furlan E.. Performance of eDNA assays to detect and quantify an elusive benthic fish in upland streams. Biological Invasions 2018;20(11):3079–3093.

40. Guseva L. N.. Food and feeding ratios of the Amur snakehead, Channo argus warpachowskii, in water bodies in the lower reaches of the Amu Darya. Journal of Ichthyology 1990;30(4):11–21.

41. Yamamoto M. N., Tagawa A. W.. Hawaii's Native and Exotic Freshwater Animals 2000. Mutual Publishing. USA:

42. Sanders R. E.. Day versus night electrofishing catches from near-shore waters of the Ohio and Muskingum Rivers. The Ohio Journal of Science 1992;92(3)

43. McDevitt A. D., Sales N. G., Browett S. S., Sparnenn A. O., Mariani S., Wangensteen O. S., Coscia I., Benvenuto C.. Environmental DNA metabarcoding as an effective and rapid tool for fish monitoring in canals. Journal of fish biology 2019;95(2):679–682.

44. Ruan H. -T., Wang R. -L., Li H. -T., Liu L., Kuang T. -X., Li M., Zou K. -S.. Effects of sampling strategies and DNA extraction methods on eDNA metabarcoding: A case study of estuarine fish diversity monitoring. Zoological Research 2022;43(2):192.

45. Ryu J. K., Nam M. M., Kim S. Y.. Seasonal Changes in Species Composition and Seasonal Variation of Fish Targeting Fishery in Lake Paldang. Korean Journal of Limnology 1999;32(4):308–318.

46. Barnes M. A., Turner C. R., Jerde C. L., Renshaw M. A., Lindsay Chadderton W., Lodge D. M.. Environmental conditions influence eDNA persistence in aquatic systems. Environmental science & technology 2014;48(3):1819–1827.

47. Tsuji S., Yamanaka H., Minamoto T.. Effects of water pH and proteinase K treatment on the yield of environmental DNA from water samples. Limnology 2017;18:1–7.

48. Tsuji S., Ushio M., Sakurai S., Minamoto T., Yamanaka H.. Water temperature-dependent degradation of environmental DNA and its relation to bacterial abundance. PLoS One 2017;12(4)e0176608.

Article information Continued

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Sampling location	Sampling location (Korean)	Sampling date	Geographic coordinate		WT (°C)	pH	Salt (ppm)	Cond. (μS)
Sampling location	Sampling location (Korean)	Sampling date	Latitude	Longitude	WT (°C)	pH	Salt (ppm)	Cond. (μS)
PL	팔당	22-06-22	37°31'58"	127°18'58"	29.3 (±0.2)	9.37 (±0.05)	116.0 (±2.2)	302.0 (±21.8)
JB	잠실	22-06-22	37°31'23"	127°05'54"	27.3 (±0.6)	7.70 (±0.00)	99.0 (±2.9)	182.7 (±20.0)
HB	행주	22-06-22	37°35'45"	126°48'29"	24.0 (±0.0)	6.90 (±0.00)	155.7 (±13.0)	252.3 (±55.2)

Location	Raw reads	Filtered reads	Denoised reads	Merged reads	Non chimeric reads	Total number of ASVs
PL	270,082	256,879	244,456	201,474	98,810	346
JB	421,892	413,422	388,294	312,914	151,276	331
HB	231,926	213,373	205,792	185,582	53,292	455
Total	923,900	883,674	838,542	699,970	303,378	1,132

Order	Family	Genus	Species	Korean name	Sampling site
					PL		JB		HB
					E	T	E	T	E	T
Anabantiformes	Channidae	Channa	Channa argus	가물치	●		●		●
Anguilliformes	Anguillidae	Anguilla	Anguilla australis				●
Atheriniformes	Hemiramphidae	Hyporhamphus	Hyporhamphus sajori	학공치						●
Beloniformes			Hyporhamphus intermedius	줄공치					●
Centrarchiformes	Centrarchidae	Lepomis	Lepomis macrochirus	블루길	●		●
		Micropterus	Micropterus salmoides	배스	●	●	●	●	●
	Sinipercidae	Siniperca	Siniperca scherzeri	쏘가리			●
Clupeiformes	Engraulidae	Coilia	Coilia nasus	웅어					●
Cypriniformes	Acheilognathidae	Acheilognathus	Acheilognathus chankaensis	가시납지리			●		●
			Acheilognathus rhombeus	납지리			●
			Acheilognathus yamatsutae	줄납자루			●	●		●
		Rhodeus	Rhodeus ocellatus	흰줄납줄개			●
			Rhodeus uyekii	각시붕어				●
		Tanakia	Tanakia lanceolata	납자루			●	●
	Cobitidae	Misgurnus	Misgurnus anguillicaudatus	미꾸리	●	●	●
			Misgurnus bipartitus		●
	Cyprinidae	Carassius	Carassius auratus	붕어	●		●		●	●
		Cyprinus	Cyprinus carpio	잉어		●		●		●
	Gobionidae	Abbottina	Abbottina rivularis	버들매치			●
		Hemibarbus	Hemibarbus labeo	누치		●		●		●
		Pseudogobio	Pseudogobio esocinus	모래무지		●		●
		Pseudorasbora	Pseudorasbora parva	참붕어			●
Cypriniformes	Gobionidae	Pungtungia	Pungtungia herzi	돌고기			●
		Sarcocheilichthys	Sarcocheilichthys nigripinnis	중고기						●
			Sarcocheilichthys variegatus	참중고기				●
		Squalidus	Squalidus japonicus	몰개				●		●
	Xenocyprididae	Chanodichthys	Chanodichthys erythropterus	강준치				●		●
		Culter	Culter alburnus		●		●		●
		Hemiculter	Hemiculter eigenmanni	치리						●
		Zacco	Zacco platypus	피라미	●	●	●	●		●
Gobiiformes	Gobiidae	Acanthogobius	Acanthogobius hasta	풀망둑					●
		Rhinogobius	Rhinogobius brunneus	밀어		●		●		●
			Rhinogobius similis	갈문망둑	●	●	●		●
		Tridentiger	Tridentiger bifasciatus	민물두줄망둑					●	●
			Tridentiger brevispinis	민물검정망둑	●	●	●	●	●	●
	Odontobutidae	Odontobutis	Odontobutis interrupta	얼록동사리	●
Mugiliformes	Mugilidae	Mugil	Mugil cephalus	숭어			●		●
		Planiliza	Planiliza haematocheilus	가숭어					●	●
Osmeriformes	Plecoglossidae	Plecoglossus	Plecoglossus altivelis	은어					●
Pempheriformes	Lateolabracidae	Lateolabrax	Lateolabrax japonicus	농어			●		●
Perciformes	Cottidae	Trachidermus	Trachidermus fasciatus	꺽정이					●
Siluriformes	Siluridae	Silurus	Silurus asotus	메기			●		●
Synbranchiformes	Synbranchidae	Monopterus	Monopterus albus	드렁허리	●